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世界首個無電極單分子納米孔檢測方法 | 南大陳洪淵、黃碩團隊《Science Advances》
發表時間:2019-09-20 11:15:46  閱讀:0   來源:互聯網

自然界中廣泛存在的物質跨膜輸運現象通過介導細胞內外物質交換在分子水平上對諸多生物學過程進行精準調控。其中,無機離子,葡萄糖,核酸,氨基酸及其它細胞代謝物的跨膜輸運需要由特定的膜通道蛋白介導完成。這些膜通道蛋白由蛋白質單體或者多聚體于生物膜上自發組裝形成跨膜孔道。膜片鉗技術可以有效的逐個探究單個膜通道蛋白的生物物理學性質。隨著越來越多新型的膜通道蛋白被發現,探究和理解,這些通道的門控動力學性質與輸運機制逐步得到了解讀。

新興的單分子納米孔技術正是建立在膜片鉗技術這一基礎上的膜通道仿生技術,其基本原理是利用電場力驅動單個分子或離子通過納米孔引起的皮安級電流變化來進行單分子檢測。納米孔技術應用廣闊,可以用于蛋白質分析,金屬離子檢測,有機小分子識別,納米粒子表征,單分子化學,單分子質譜以及DNA測序。然而,自1993年首個納米孔傳感概念的展示以來,無論納米孔技術的儀器形式如何變化,其檢測機理完全是來源于依賴膜片鉗技術的電信號檢測方法。雖然這種方法具有超高的時間分辨率(~10 μs)和電流分辨率(<0.1 pA),但受限于現有的微電子和微電極加工技術的技術門檻和成本限制,擴大檢測通量是該領域的主要瓶頸。現階段,單分子基因測序是納米孔傳感領域內最重要的應用,同時也伴隨著海量的數據采集需求,隨著納米孔測序技術產業化逐步展開,人們對超高通量納米孔測序(大于100萬個孔道)的需求愈發迫切,因此亟待發展一種新型的納米孔檢測模式,以不顯著提高檢測成本為前提突破現有檢測通量的局限。

數十億年的生物進化過程早以篩選出一系列結構最為精簡,運轉最為高效的跨膜輸運機制。T4噬菌體能專一地吸附在寄主細胞表面的相應受體上, 將頭部的DNA通過中空的尾部(直徑為2.5~3.5 nm)注入宿主細胞內。金黃色葡萄球菌分泌的α溶素 (α-HL) 能夠插到宿主細胞的細胞膜上,導致細胞營養物質流失而溶解。與通過電極對并使用膜片鉗儀器驅動的納米孔技術不同,自然界中的跨膜運輸過程往往自發產生,且完全不需要冗余的電極和膜片鉗等外圍電子器件的輔助,是最簡化的物質跨膜輸運分子機器。

世界首個無電極單分子納米孔檢測方法 | 南大陳洪淵、黃碩團隊《Science Advances》

圖1: 無電極納米孔技術原理與應用。左上: 無電極納米孔技術示意圖。凝膠中的鈣離子自由擴散穿過納米孔與液滴中的鈣離子熒光染料結合,產生熒光信號。右上: 基于無電極納米孔技術的單分子傳感。分子穿過納米孔時會產生特異性的堵孔熒光信號,可用于環糊精、聚乙二醇和雙鏈DNA的傳感。左下: ClyA納米孔和α-HL 納米孔的同時成像與區分。由于孔徑不同 (ClyA納米孔: d= 3.6 nm, α-HL納米孔:d=1.4 nm), ClyA納米孔在熒光模式下能產生一個明亮的亮斑(紅圈),而α-HL納米孔則表現為一個微弱的亮斑(黃圈)。右下: ClyA納米孔微液滴陣列。

受此啟發,南京大學生命分析化學國家重點實驗室陳洪淵、黃碩團隊開發了一種新型的納米孔檢測方法,并將其命名為無電極納米孔技術(DOP,Diffusi Opto Physiology),也是世界首個無需電極的單分子納米孔檢測方法。該團隊在納米孔的兩側分別加入鈣離子與鈣離子熒光染料,在濃度梯度驅動下,鈣離子自由擴散穿過納米孔與熒光染料結合釋放熒光信號,從而間接實現-納米孔在液滴-凝膠界面雙分子層上實時成像,并成功展示了其對小分子、高分子與生物大分子的單分子傳感。這項技術充分簡化了傳統的納米孔檢測模型(能斯特-普朗克方程,公式1),去掉了電遷移項在物質傳遞中的貢獻,僅由擴散、化學反應和流體三項來描述物質的傳遞(公式2):

公式1(電生理納米孔檢測模型):

世界首個無電極單分子納米孔檢測方法 | 南大陳洪淵、黃碩團隊《Science Advances》

公式2(DOP模型):

世界首個無電極單分子納米孔檢測方法 | 南大陳洪淵、黃碩團隊《Science Advances》

通過進一步對電解質溶液與孔道優化,其傳感性能可與傳統的電生理納米孔技術相當,而理論檢測密度可高達10pores/mm2。由于DOP無需預留電極空間,其測量體積可進一步減小到~30 pL,檢測體積上是現有納米孔技術的百萬分之一,顯著降低了樣品消耗,非常適用于豐度極低的分析物測量。此外,不使用電極讓研究者可以很輕松的構建微液滴DOP檢測陣列。這種檢測模式非常適用于多組分,平行化的高通量藥物篩選,其理論檢測密度可達103bilayers/ mm2(圖1)。在此基礎上,該團隊構建了高通量可拋棄式單分子分析芯片,該芯片僅需簡單且無生物毒性的材料構成,現有芯片成本不足1美元,非常適用于臨床檢測中的可拋棄式檢測需求,并有望進入日常生活。

世界首個無電極單分子納米孔檢測方法 | 南大陳洪淵、黃碩團隊《Science Advances》

圖2:無電極大孔徑ClyA納米孔檢測dsDNA


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